NCM460人正常结肠细胞培养要点
NCM460人正常结肠细胞培养要点
该细胞来源于西班牙裔，来自胃癌患者的正常结肠；粘膜组织。倍增时间：32-38小时（INCELL），自发性永生化细胞系。
1
细胞特性
来源：人结肠
形态：上皮细胞样，贴壁生长
含量：>1x10^6 细胞数
规格：T25瓶或者1mL冻存管包装
用途：仅供科研使用。
2
细胞培养步骤
1. 准备1640基础培养基（E2103）；10%FBS (E01021)；1% 双抗（E3102）。
2. 培养条件： 气相：空气,95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3. 冻存液：90%FBS(E01021)，10%DMSO，现用现配。
1. 冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。
在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。
然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸.
2. 细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
（1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS(E2119)润洗细胞1-2次。
（2）加入0.25％胰蛋白酶EDTA(E3103)于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS(E01021)的培养基来终止消化。
（3）轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3. 细胞冻存：收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
下面T25瓶为例：
（1）细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×10^7个活细胞/ml.
（2）1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
（3）将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
(1). 部分细胞在传代后时，会有以下现象：
细胞内会有黑色小点、细胞间隙有些颗粒物、 培养基漂浮一些死细胞。以上都是细胞培养常见现象，不影响细胞增殖和实验。
细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡、细胞器折光或者细胞膜表面物质，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，具体情况可以参考 ATCC、DSMZ 等大型细胞 库细胞照片。细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片，可以吸走培养基后用 PBS( E2119)润洗；润洗不能清除的可以消化细胞重新接种，消化完成后加完全培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液 900-1000rpm(约 150g)离心 3min，弃上清。再加 5ml PBS (E2119）重悬细胞，再离心后，用完全培养基重悬接种到新的培养皿。第二次 PBS（E2119） 重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略 PBS (E2119)重悬的步骤； 如果碎片很多，建议 PBS (E2119)多洗几次。
(2). 细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。不同品牌胰酶溶液成分不一样，消化活性差别比较大，更换胰酶品牌时需重新摸索消化时间，以消化到细胞间隙变大但未漂浮为准，此时结束消化最佳，避免消化过 度导致细胞死亡。细胞消化后比较脆弱，吹打力度不要过大，不要产生过多气泡， 否则会严重影响细胞状态。
(3). 不同细胞生长速度差异较大，所有细胞收货后首次传代建议按 1:2 传代。正常培养 时生长较慢、密度较低的细胞需要传代时按 1:2 传代，生长较快、密度较高的细胞 可以按 1:4 传代。
(4). 细胞生长偏慢时，可以提高 5-10%血清浓度（血清总浓度不超过20%）培养一段时间，待细胞状态和生长速度恢复正常后换回正常血清浓度
*本文涉及到胎牛血清及培养基均来自于Evacell品牌
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