RAW264.7细胞培养要点

细胞描述

细胞特性

1） 来源：鼠科白血病病毒诱导的肿瘤；单核细胞；巨噬细胞

2） 形态：不规则圆形，纺锤状，贴壁细胞，少量悬浮。

3） 含量：>1x106  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5） 用途：仅供科研使用。

细胞培养步骤

（1）准备DMEM培养基(E2102),  10 % FBS(E01010)；1% P/S青霉素-链霉素(E3102) 。

（2）注意事项：

（a）在细胞生长的初始阶段，细胞以贴壁的形式生长并呈现出长方体的形态和有“伪足”延伸。随着培养时间的增加，细胞呈现圆形并以叠加的形式生长。细胞密度达到一定的程度，会有细胞以悬浮的方式散落到到培养基中，镜下观察会发现悬浮和贴壁的细胞会同时出现。

（b）该细胞传代时不需要用胰酶消化。（胰酶会刺激RAW264.7细胞严重分化）传代时，用无菌细胞刮刀刮拭培养表面将细胞刮落，收集离心后重悬接种到新的培养瓶中。注意用腕力刮，不要用臂力，且切记只能刮一次，不要来回刮和反复刮，吹打的力度一定要轻，且勿暴力吹打。

(c)该细胞形态上包含松散贴壁的纺锤形和圆形或者立方形。当细胞密度较大时，细胞会轻微脱落变圆或者许多细胞堆积在一起，有些细胞甚至脱落漂浮。这些漂浮的细胞是存活的，在传代时应收集起来，离心后细胞沉淀可以继续培养。

(d)换了血清批次后巨团严重，换血清批后严重巨团的raw264.7细胞，原因推断血清来源于动物，其组成成分有1000种左右，且血清组成及含量,随供血动物的年龄，分泌条件和营养条件而议，每个批号的组分百分比含量都是不固定的，所以批间差异是存在的。而raw细胞本身有聚团生长特性，但严重聚团可能受到血清里的毛血因子刺激。解决办法，先用血清试用装，试用效果好可购买和血清试用装批次相同的正装，囤集半年或一年的用量，可有效避免批间差对细胞的影响。血清质量差异也可能引起细胞贴壁能力变化。

(e)有分化的细胞说明细胞状态不好吗？细胞群中有个别细胞出现触角，培养时无法保证100%不分化，通过传带可以将分化的比例控制在一定范围，Raw264.7细胞生长速度快，两到三天即可传一代，传带的时间间隔超过三天更容易分化，很难吹下，每次接触密度要控制好。解决办法，推荐传带比例为1 : 3到1 : 6，推荐传带时间两到三天推荐传代融合率70%-90%。

（3）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

（4） 冻存液：90%FBS(E01010)，10%DMSO，现用现配。

（1）冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。

然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

（2）细胞传代

如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：

该细胞用细胞刮铲替代胰酶来对细胞进行处理。用无菌细胞刮铲刮拭细胞附着培养表面将细胞刮落，收集细胞后离心去上清，重悬后接种到新的装有新鲜培养液的培养瓶内。收货后第一次传代1:2进行，后续可以根据实际的情况以1:2~1:4的比例进行传代。

（3）细胞冻存

收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1. 细胞用细胞刮铲替代胰酶来对细胞进行处理。用无菌细胞刮铲刮拭细胞附着培养表面将细胞刮落，收集细胞。

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。