293T细胞培养要点
细胞描述
293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如HEK293，293T/17等，来源都是人胚胎肾细胞，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，该细胞最初的名字是 293tsA1609neo，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。 因此293T细胞广泛应用于逆转录病毒生产、基因表达和蛋白表达。
细胞特性
来源: 人 胚胎肾脏
形态: 上皮样细胞 贴壁生长
含量：>1x106 细胞数
规格：T25瓶或者1ml冻存管包装
用途: 仅科研使用
一.培养基及培养冻存条件准
（1）准备DMEM高糖培养基（E2102）；优质胎牛血清（E01011）， 1% 双抗 （E3102）, 建议在完全培养基中添加1%L-谷氨酰胺；1% NEAA ）。
（2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37°C，培养箱湿度为70%-80%。
（3）冻存液：90%血清(E01011)，10%DMSO，现用现配。
二.细胞处理 （1）冻存细胞的复苏： 将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。 （2）细胞传代： 如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。 该细胞贴壁能力较弱(半贴壁半悬浮）细胞，，传代可以参考以下方法： 1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS（E2119）润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS（E2119）润洗后细胞会脱落所以PBS(E2119)也要回收到离心管中。 2. 加入0.25％胰蛋白酶EDTA（E3103）于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS(E01011)的培养基来终止消化。 3. 将收集到的悬浮细胞、PBS(E2119)清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。 （3）细胞冻存 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。 下面以T25为例 1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10*6~1×10*7个活细胞/ml. 2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10*6~1×10*7个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。 3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。 293T细胞培养要点 细胞贴壁性较差，容易飘起来，37℃静置可重新贴壁。换液时注意不要用力摇晃培养瓶，否则有可能会把细胞摇下来 细胞容易消化，消化下来的细胞容易成团，要吹打吹散。否则传代后细胞会成团生长，不均匀，影响实验结果。 当细胞生长至汇合率达到70~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等情况。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。 三.细胞培养问题与解决方法 为啥293T细胞传代后聚团严重？ 原因推断：胰酶消化操作不当导致细胞聚团。 A.消化过度或吹打过猛导致细胞受伤严重，破损的细胞碎片容易粘连聚团。 C. 消化时细胞融合率太高，成片脱落，将不容易被吹散，容易聚团。 D. 鉴于该细胞贴壁疏松，0.25%胰酶消化时间控制30s-60s，消化时间过长，对细胞会造成损伤，影响其活力，甚至细胞破碎。 解决办法：鉴于该细胞贴壁疏松，0.25%胰酶(E31030)消化时间控制15s-30s,具体根据细胞的情况而定；吹打动作轻柔，控制在10-20次；细胞融合率达到70%-90%传代即可传代，不可长的太满。 为啥293T细胞换了血清批次后成团严重? 原因推断：血清批次间存在差异 血清来源于动物，其组成成分有1000种左右，且血清组成及含量常随供血动物的年龄、生理条件和营养条件而异。每个批号的组分百分比含量都是不固定的，所以批间差异是存在的。293T细胞本身有聚团生长特性，但严重聚团可能受到血清里的某些因子刺激。 解决办法：先用血清试用装，试用效果好，再购买和血清试用装批次相同的正装，囤积半年或一年的用量，有效避免批间差对细胞的影响（胎牛血清在-20℃保存可达5年，推荐使用（E01011）。 为什么用了新批号的血清，293T细胞贴壁性变差？ 原因推断：血清存在批间差异，而293T细胞本身特点就是贴壁性差，对不同批次的血清适应性不同，就容易出现贴壁疏松现象。 解决办法：可适当加高血清比例（最高不超过20%）；建议试好一个血清批次多囤一些，可以避免血清批间差对细胞的影响。 为啥293T细胞从T25瓶里铺板到96孔板里，贴壁性变差？ 原因推断：排除掉瓶和孔板本身材质或TC（亲水处理）处理因素外，293T细胞贴壁性变差极有可能是因为空间的隔离导致细胞自分泌或旁分泌产生的信号分子浓度太低，不利于细胞的贴壁或增殖。 解决办法：在铺板前，对孔板进行明胶包被，可有效促进细胞贴壁。 为什么293T细胞转染后凋亡严重？ 原因推断：在排查了方法步骤和转染试剂，依然没有改善的情况下，可排查一下转染前的营养体系，尤其是血清批间差带来的影响。很多同学说前期培养细胞形态正常呀，其实细胞形态学只是鉴别细胞是否健康的一个外在指标，还要结合细胞其它指标对细胞健康进行评定（比如倍增时间，存活率）。 解决办法：通过更换血清批次，再进行转染实验并观察转染后的效果，比较分析出原因。 1.具有一致的结果和细胞具有高度可重复性 2.可以高效地大量生产重组蛋白，使其成为新药开发的主流贡献者。 3.可用于稳定和瞬时基因表达 4.HEK 293 细胞对转染有明显的反应，并且可以在转染中使用不同的化学和物理方法。 注意事项： 1. 加入1×PBS(E2119)时尽量贴壁加，不要直接对着细胞，以免将细胞吹开，大片脱落； 2. 培养基及1×PBS(E2119)实验前37℃水浴箱预热； 3. 操作过程严格无菌操作； 4. 加入0.25%胰酶（E31030）后，可以轻敲培养皿，观察细胞呈流沙状即为消化完成。 5.如果发生293T细胞不贴壁，漂浮在培养基中的现象，可以酌情在培养基中添加（L-谷氨酰胺（2mM）1%；NEAA 1% ）以便正确缓冲培养基。促使悬浮细胞更好的存活以及细胞更容易贴壁。 *本文涉及到胎牛血清及培养基均来自于Evacell品牌
- 上一篇：RAW264.7细胞培养要点
- 下一篇：beNd.3细胞培养体系
-
2025-03-27HepG2细胞培养要素
-
2024-05-15beNd.3细胞培养体系
-
2024-05-15293T细胞培养要点
-
2024-05-15RAW264.7细胞培养要点
-
2023-03-25NCM460人正常结肠细胞培养要点
-
2023-03-17RAW264.7细胞培养要点