HepG2细胞是一种来源于15岁男性白人肝癌组织的细胞系，能够大容量培养，乙肝表面抗原阴性，对G418有抗性，并对人生长激素有刺激反应。该细胞分泌多种血浆蛋白，包括清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等，并表达3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。细胞特性
1）来源：肝细胞癌
2）形态：上皮细胞样，贴壁生长
3）含量：>1x106 细胞数
4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装
5)用途：仅供科研使用。
一．培养基及培养冻存条件准备：
1） 准备MEM含（NEAA）培养基（推荐使用E2124）；10%优质胎牛血清（E01011）；1%双抗（E3102）。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：建议使用无血清冻存液（E4111）,或90%FBS（E01011）＋10%DMSO，现用现配。
1）冻存细胞的复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。 2）细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。该细胞为轻微贴壁和少量悬浮培养细胞，传代可以参考以下方法： 1. 收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。 2. 加入0.25％胰蛋白酶 (含EDTA）于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS（E01011）的培养基来终止消化。 3. 将收集到的悬浮细胞、PBS清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。 3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。 1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml。 2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。 3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。 HepG2细胞中常有空泡，这是该细胞正常特性，不影响细胞生长，无需担心。 若细胞生长过慢甚至不生长，可将血清增加至15%-20%(不要超过20%)，待细胞恢复生长速度后再将血清比例降低到10%。细胞接种密度不可过低，否则生长非常缓慢。 血清品牌和培养基pH是影响HepG2细胞贴壁性的关键因素。使用高质量低内毒素未灭活的胎牛血清，可以帮助细胞更好地贴壁及形成单层细胞。pH过高过低都将影响细胞贴壁性，每天观察培养器皿中培养基的颜色，偏黄及时换液，偏紫时检查培养箱CO2供应是否正常，培养瓶是否透气，并及时换液。 排除血清和pH对细胞贴壁的影响，传代或复苏后若有部分细胞漂浮，是正常现象，随着培养部分漂浮细胞会逐渐贴壁。漂浮细胞较多时不要扔，使用台盼蓝检查细胞活性，若大部分是活细胞，将这些细胞离心收集后重新接种至原瓶。增加血清量(总比例不超过20%)可以促进贴壁1。 这在HepG2培养时是常见现象，这些细胞可能是尚未完全贴壁或者正处于分裂期的细胞，无需对此特殊处理。 1. HepG2细胞的生长特点就是呈岛状生长，并且岛状生长的细胞扩张能力有限，长到一定大小之后就会堆积生长。 2. 要想细胞分散均匀，一方面是需要保证细胞消化过程中分散良好，另外一方面接种的初始密度不宜过低，否则就会有大面积的空白区域。 3. 另外如果实验需要HepG2为分散良好的单层细胞，可以用多聚赖氨酸包被培养瓶后培养，细胞将会呈单层分散的形式生长，但是形态跟不包被时差异比较大，会变成长梭形细胞。*本文涉及到胎牛血清及培养基均来自于evacell品牌
*本实验数据及要点仅供参考
