HUVEC人内皮细胞

该细胞来源于人静脉内皮，可在半固体培养基中形成克隆，在免疫抑制小鼠中不能形成肿瘤。血管内皮细胞有助于维持血管平衡。血管内皮细胞产生并分泌凝血和纤维蛋白溶解系统的激活剂和抑制剂。此外，它们还介导血小板的粘附和聚集。内皮细胞还会释放调节细胞增殖和控制血管壁张力的分子。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）是体外研究内皮细胞过程最常用的细胞类型。

细胞特性

1） 来源：人脐带组织

2） 形态：内皮细胞样 贴壁生长

3） 含量：>1x10⁶细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5)  用途：仅供科研使用。              

一、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备内皮细胞培养体系 : 93%  内皮细胞培养基础培养基 ,  5%  胎牛血清（FBS)(E01011）  ，1%  内皮细胞培养添加剂 ,1% 青霉素/链霉素溶液  (E3102)                         

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

  二、操作流程：

复苏

1)  将恒温水浴锅中的水预热到37℃;

2)  准备一支 15ml 离心管，加入 5ml 含 10%FBS 的完全培养基，放入 37℃水浴锅中预热；

3)  戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中 复温晃动冻存管以提高复温速率；

4)  将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm 离心 5min；

5)  准备一个 T-25 培养瓶，写上细胞名称、 日期，再加入 4ml 完全培养基；

6) 离心完成后弃去上清，用 1ml 完全培养基重悬细胞后，转入 T-25 细胞培养中，混匀后转入 CO₂ 培养箱中培养静置。

传代（细胞传代建议一传二）

1)  当细胞汇合度达到 85%以上时，可进行传代。

2) 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；

3)向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS （E2119） 后，水平放置培养瓶，使 PBS(E2119) 能够浸润到培养瓶底面上 所有的面积，吸弃 PBS(E2119)；

4) 向瓶内加入消化液 1ml ，浸润底面后放入 37℃  CO₂ 培养箱中孵育 1~2min；

5)  孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中，将悬液吸入 15ml 离心管；

注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：

①准备一个无菌的15ml 离心管，加入2ml 含10%FBS 的完全培养基；

②将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）

③向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入① 中的离心管内

6)   1000rpm 离心 5min；

7)  准备两个新的 T-25 培养瓶，各加入 4ml 完全培养基。

8)  离心完成后，弃上清，用 2ml 完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入 2 个 T-25 培 养瓶，每个培养瓶各 1ml；

9)  水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃ , 5%CO₂ 培养箱中静置培养。

  冻存（细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支）

1）~6）参照传代步骤

7）离心完成后，弃上清，用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀，然后转入 1.8ml 冻存管中；

8）将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；

9）第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。

三：培养HUVEC细胞常见问解决方案及注意事项

HUVEC细胞为什么消化不成单细胞？

答：消化不成单细胞有以下可能原因：

1.胰酶的浓度不够或者消化时间不够长。可以尝试增加胰酶浓度或者增加消化时间。

2.细胞过老或者过密。长时间的细胞传代可能会导致细胞老化、聚集，从而难以消化成单细胞。

3.细胞的附着力过强。可以尝试使用EDTA或者其他解离剂来削弱细胞与培养基或者基质的黏附力，帮助消化成单细胞。

4.操作不当。可能在操作过程中过于粗鲁或者未均匀加入胰酶，导致消化不均匀，出现难以消化成单细胞的情况。

2.细胞培养过程中如何进行细胞质量控制，让实验结果稳定？

答：在体外细胞培养过程中，离开机体保护的细胞是非常脆弱的，在不熟悉的生长环境中，即使培养条件的微小变化也可能对细胞产生不可预测的影响。在原代细胞培养过程中，即使培养条件完全一致，细胞的存活质量也会在传代过程中逐渐下降。HUVEC细胞是研究内皮细胞功能的经典体外细胞模型。在心血管疾病的研究中，主要用于研究其衍生的细胞因子引起的内皮细胞功能改变或损伤对血压的影响;在肿瘤研究中，主要用于实体瘤血管生成的研究。但在传代培养过程中，HUVEC的活力逐渐下降，因此细胞传代建议最多不超过10-20代。通过细胞活力、细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、DNA损伤五个方面对细胞生长和存活状态进行全面监测，来完成细胞在这五个方面中，影响最大的是细胞活力。为确保实验结果的稳定，建议尽早完成实验。

注意事项：

  1.HUVEC细胞具有如下特性

◆ 细胞膜很薄，边界不清晰，较难观察。

◆ 细胞为有限传代细胞系，请注意代次控制，1：2传代。

◆ 细胞有聚团堆叠生长的特性，注意细胞接种要均匀，及时传代

  2.细胞贴壁较弱

该细胞贴壁比较弱，因此在遇到运输低温及震荡、室温静置太长时间、添加的培养基或其他试剂过冷等情况时会出现明显的细胞回缩变粗变短的现象，及时放回培养箱静置培养后可恢复正常。

3.对消化非常敏感

　　该细胞在消化时极易受损，需要非常精细的控制消化操作、消化时间及吹打力度。若控制不好，会导致细胞形态异常、生长速度减慢甚至无法继续传代培养，很容易出现传代一两次就无法继续生长传代的情况。另外不同品牌胰酶消化时间差别较大，注意严格控制消化时间，消化传代细胞时吹打细胞注意尽量轻柔，不要产生过多气泡以免影响细胞状态

4..对培养基要求高

　　该细胞需使用内皮细胞专用培养体系培养，否则可能出现细胞死亡或无法生长情况。

5.原代永生细胞

该细胞由原代人脐静脉内皮细胞通过SV40转化而获得，该细胞为有限传代细胞系，在体外培养可传20-30代（具体视情况而定）。请注意代次控制。建议尽早完成实验。

*本文涉及到胎牛血清及培养基均来自于Evacell品牌