HCT-116细胞培养要点

细胞特性

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

二． 细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

1) 当细胞汇合度达到 85-90%以上时，可进行传代。

2) 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；

3) 向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS 后，水平放置培养瓶，使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃 PBS；

4) 向瓶内加入1ml消化液 ，浸润底面后，室温消化 2~5min；

5) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入 2ml 含 10% FBS 的完全培养基中，将悬液吸入 15ml 离心管；

6) 1000rpm 离心 5min；

7) 准备两个新的 T-25 培养瓶，各加入 4ml 完全培养基。

8) 离心完成后，弃上清，用 2ml 完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入 2 个 T-25 培 养瓶，每个培养瓶各 1ml；

9) 水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于 37℃，5%CO₂培养箱中静置培养。

（3）细胞的冻存

建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；1. 细胞用细胞刮铲替代胰酶来对细胞进行处理。用无菌细胞刮铲刮拭细胞附着培养表面将细胞刮落，收集细胞。

三，细胞常见问题

1.细胞难消化

如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：① 准备一个无菌的 15ml 离心管，加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基；② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；③ 向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱 落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内

2.HCT-116人结肠癌细胞用DMEM高糖培养基还是McCOY's 5A？

具体根据购买时的细胞库来决定用哪种培养基，因为每株细胞都有其特定使用并且已经适应的培养基，经过一定的驯化，若突然更改培养条件，细胞有可能出现不适应，生长缓慢，死细胞出现，造成细胞无法存活。也有细胞在更换培养基后生长也能正常，细胞状态也还可以维持。但是问题会出现在冻存后期的复苏过程，有可能让细胞无法复苏，所以建议不要随便更换培养基。

（使用Evacell胎牛血清）

注意事项:

1. 消化时不要通过敲击或摇晃烧瓶来搅动细胞，以免形成细胞团。

2. HCT-116 细胞胞体上有黑色颗粒是正常现象

3.不同品牌胰酶溶液成分不一样，消化活性差别比较大，更换胰酶品牌时需重新摸索 消化时间，以消化到细胞间隙变大但未漂浮为准，此时结束消化最佳，避免消化过 度导致细胞死亡。细胞消化后比较脆弱，吹打力度不要过大，不要产生过多气泡， 否则会严重影响细胞状态。

*本文涉及到胎牛血清及培养基均来自于Evacell品牌