CT26细胞培养要点

CT26细胞培养

一、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基（E2103） ,  10%  胎牛血清（FBS)(E01011）  ，0.4mg/ml  G418 ,1% 青霉素/链霉素  (E3102)，                         

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 

温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

二、操作流程：

复苏

1)  将恒温水浴锅中的水预热到37℃;

2)  准备一支 15ml 离心管，加入 5ml 含 10%FBS 的完全培养基，放入 37℃水浴锅中预热；

3)  戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中 复温晃动冻存管以提高复温速率；

4)  将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm 离心 5min；

5)  准备一个 T-25 培养瓶，写上细胞名称、 日期，再加入 4ml 完全培养基；

6) 离心完成后弃去上清，用 1ml 完全培养基重悬细胞后，转入 T-25 细胞培养中，混匀后转入二氧化碳 培养箱中培养静置。

传代（细胞传代建议一传二）

1)   当细胞汇合度达到 85%以上时，可进行传代。

2)  在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；

3)   向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS （E2119） 后，水平放置培养瓶，使 PBS(E2119) 能够浸润到培养瓶底面上 所有的面积，吸弃 PBS(E2119)；

4)   向瓶内加入消化液 1ml ，浸润底面后放入 37℃二氧化碳培养箱中孵育 1~2min；

5)  孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中，将悬液吸入 15ml 离心管；

注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：

① 准备一个无菌的 15ml 离心管，加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基；

②将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；

③ 向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入① 中的离心管内。

6)   1000rpm 离心 5min；

7)  准备两个新的 T-25 培养瓶，各加入 4ml 完全培养基。

8)  离心完成后，弃上清，用 2ml 完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入 2 个 T-25 培养瓶，每个培养瓶各 1ml；

9)  水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃ , 5%二氧化碳培养箱中静置培养。

冻存（细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支）

1）~6）参照传代步骤

7）离心完成后，弃上清，用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀，然后转入 1.8ml 冻存管中；

8）将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；

9）第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。

三、培养CT26细胞常见解决方案及注意事项

1. CT26 细胞到底用1640基础培养基还是DMEM高糖培养基？