BV2小鼠小胶质细胞培养要点

BV2小鼠小胶质细胞

该细胞来源于德国DSMZ（German collection of microorganisms and cell cultures），源于C57BL/6小鼠小胶质细胞，表达核v-myc、染色体v-raf癌基因，表面表达envgp70抗原，在形态学、表型及功能上有吞噬细胞的特征。免疫组化结果显示BV2为MAC1、MAC2阳性，而MAC3、胶质细胞原纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂为阴性。且是高度纯化的永生细胞系，同时该细胞系具备了原代培养的小胶质细胞的形态学、表型以及各项功能特点，相较于原代培养的细胞而言，永生化的细胞系培养起来更为容易。因此目前被广泛的运用于科学研究当中。

细胞特性

1） 来源：小鼠脑

2） 形态：上皮细胞样 松散贴壁，悬浮和贴壁细胞混合生长

3） 含量：>1x10⁶  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5)  用途：仅供科研使用。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备MEM含（NEAA）培养基（推荐使用E2124）/DMEM高糖培养基（E2102）；

10%优质胎牛血清（E01011）；

1%双抗（E3102）; 

   L-谷氨酰胺 (100x)溶液（E3109）.

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：建议使用无血清冻存液（E4111）,或90%FBS（E01011）＋10%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。

然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：

如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞为轻微贴壁和少量悬浮培养细胞，传代可以参考以下方法：

1. 收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2. 加入0.25％胰蛋白酶 (含EDTA）于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS（E01011）的培养基来终止消化。

3. 将收集到的悬浮细胞、PBS清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min。

弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3） 细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml。

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

三．培养过程中可能遇到的问题及解决方法

1. BV2用MEM（含NEAA）培养可以吗？

答：可以的，这个细胞有两种培养条件，DEME和MEM(含NEAA)，所以使用MEM(含NEAA)培养BV2细胞是可行的，但需要确保培养基中含有足够的营养成分，如血清和其他补充物。

如果在使用MEM(含NEAA)过程中遇到生长缓慢或细胞状态不佳的问题，可以考虑调整培养基成分或改为使用DMEM。通过仔细观察和记录细胞生长状态并根据需要调整培养条件，可以确保BV2细胞在DEME或MEM(含NEAA)培养基中的良好生长。

2：BV2细胞形态的问题：培养过程梭型细胞比圆形细胞多，梭型是不是细胞分化了？

答：细胞受到LPS刺激后易分化，而常规培养过程是不会自发分化的。关于哪种形态是分化，并没有统一的定论，有的文献描述分化细胞是长梭型细胞增加，有的文献称分化细胞偏圆形，建议通过检测相关的指标变化来判断是否分化。 该细胞在培养时，高密度下贴壁的细胞形态会偏圆形，低密度下贴壁细胞形态会偏长条形。密度比较高的时候，漂浮的细胞会聚团。存在圆形和梭形两种细胞形态。

3：BV2细胞传代培养时，发现细胞拉丝、触角较多，如何调整？

答：BV2细胞以较低密度传代后，容易出现拉丝、触角较多的情况。这种情况可以先收集培养基中悬浮或贴壁不牢的细胞于15 mL离心管中，贴壁的细胞用胰酶消化1 min左右后终止消化，收集消化下来的的细胞（多触角或者拉丝很长的细胞，短时消化不容易消化下来，可以被筛掉），然后计数传代，培养一段时间后细胞状态会有好转。没有消化下来的细胞也可以提高细胞密度传代，重复此步骤，收集偏圆形的细胞培养。

4：培养细胞的培养瓶可以重复利用吗？

答：一般不建议重复利用，特别是贴壁不牢固细胞，重复利用会导致吸附性变差，漂浮增多；一个T25瓶建议使用最多不超过3次，其次需要注意无菌操作，避免污染。

BV2注意事项：

 1.BV2细胞对培养基条件敏感，当培养基出现    过酸或者过碱的情况都会出现脱壁现象，尤其过碱时，会出现快速脱壁现象。

因此在培养过程中需关注细胞培养基的酸碱度，当培养基颜色呈现粉紫色时，PH值大概率偏高，需及时收集培养皿中的悬浮细胞，进行离心换液，更换为新鲜的完全培养基。

若使用的是培养瓶，应注意瓶口是否为透气瓶口，若不是带有透气口的款式，在使用时应拧松瓶口，保证瓶内CO₂浓度为细胞正常生长所需浓度。

 2.BV2细胞易出现分化现象，分化后的细胞贴壁更牢，极难消化，因此应尽量缩短消化时间，预防细胞分化。

若已经出现严重分化的情况，则可以尝试通过轻柔的吹打将部分细胞吹下来，并悬浮细胞一起收集，无法吹打下来的细胞直接舍弃，从而降低细胞的分化程度。但吹打时也要切记，不可暴力吹吸，避免对细胞造成机械刺激。

*本文涉及到胎牛血清及培养基均来自于evacell品牌  

本实验数据及要点仅供参考

ps:以上细胞培养内容全部源于evacell品牌公众服务号