人结肠癌细胞HCT-116培养要点

人结肠癌细胞HHCT-116EPG

HCT-116是1979年M.Brattain等从患结肠癌的男性病人中分离的三株恶性细胞之一。 在半固体琼脂糖培养基中形成克隆。HCT116在无胸腺的裸鼠有致瘤性，形成上皮样的肿瘤.

细胞特性.

1） 来源：结直肠癌

2） 形态：上皮细胞样，贴壁生长

3） 含量：>1x10⁶  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5)  用途：仅供科研使用。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备McCoy's 5A培养基（E2110）；10%优质胎牛血清（E01011）；1%双抗（E3102）。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：建议使用无血清冻存液（E4111）,或90%FBS（E01011）＋10%DMSO，现用现配。

二． 操作流程：

1）冻存细胞的复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS(E2119)润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2. 加入0.25％胰蛋白酶 (含EDTA）(E31030)于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS（E01011）的培养基来终止消化。

3. 轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3） 细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml。

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

HCT-116细胞特点：

1.HCT-116细胞生长较快，通常在合适的培养条件下，细胞可以在2-3天内达到80%-90%的汇合度。

2.对培养基的要求较为常规（McCoy's 5A + 10% FBS），不需要特殊的添加物。

3.细胞贴壁性好，形态稳定，适合新手培养。

HCT-116细胞培养中的注意事项：

 1.细胞生长速度较快：当细胞汇合度达到80%-90%时，应及时传代，如果传代不及时，细胞容易过度生长，导致细胞状态变差或发生分化。

 2.该对胰酶消化敏感：使用0.25%胰酶（含EDTA）(E31030) 消化细胞，消化时间一般为1-2分钟（37°C）。消化后及时加入含血清的培养基终止反应，避免细胞损伤。消化时间过长或胰酶浓度过高可能导致细胞损伤，影响后续生长。

 3.污染风险：与其他细胞系一样，HCT-116细胞也容易被细菌、真菌或支原体污染，需要严格的无菌操作。

      本实验数据及要点仅供参考