解锁A549肺癌细胞培养秘籍：从入门到精通的实用指南！

A549 人肺癌细胞

该细胞系由D.J.Griad通过肺癌组织移植培养建系，患者为58岁白人男性。A549能通过胞苷二磷酸胆碱途径合成含有高含量不饱和脂肪酸的卵磷脂。

细胞特性

1） 来源：肺癌

2） 形态：上皮细胞样，多角形；贴壁生长

3） 含量：>1x10⁶ 细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5）用途：仅供科研使用。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备F-12K(E2114)培养基；优质胎牛血清，10%(Evacell ,E01010）；

      双抗，1%(Evacell ,E3102)。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：推荐使用无血清冻存液（E4111）或者90%血清（E01010），10%DMSO，现用现配。

二、细胞处理：

1） 冻存细胞的复苏：  

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS（E2119）润洗细胞1-2次。

2. 加入0.25％胰蛋白酶(含EDTA，E31031)于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS（E01010）的培养基来终止消化。 

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存: 

收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

注意事项

1. 请务必要使用新鲜完全培养基和新的 T25 培养瓶进行细胞传代。请不要继续使用原培养瓶的培养液，本库培养液不含抗生素。用户可根据自己实验室具体情况选择加双抗（(Evacell ,E3102）。

常见问题

1、何时须更换培养基

视细胞生长密度而定，常规细胞2-3天更换培养基。

2、何时进行传代

细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

首次传代建议1：2传代，就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

3、细胞冻存浓度是多少

1*10⁶-1*10⁷之间都可以。

4、冻存细胞数量计算

如果是有要求每管要冻多少细胞，那就用1ml完培重悬后，取部分按平时方法计数，剩下的细胞按计数需要的细胞量冻存即可。

如果没要求，那就按平时，一个皿冻一管。

5、离心速率应为多少

细胞传代或冻存时欲回收细胞，其离心速度一般为800-1000 rpm/min，室温离心5-8分钟，转速过高，将造成细胞破裂死亡。

6、A549细胞到底用哪种培养基,可否使用与原先不同培养基

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，易造成细胞状态不好，最终造成细胞无法存活。常规推荐使用F-12K培养基，但有些实验室里会使用DMEM高糖培养基还有一些会使用1640培养基，具体使用哪种，需根据购买细胞的培养条件来决定用哪款培养基。

7、可否使用与原先不同血清种类

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

总结：

1.呈上皮细胞样，多角形，贴壁生长较快

2.推荐使用F-12K培养基

3.维持细胞密度在6000-60000cells/平方厘米

4.推荐传代比例为1:3至1:4，建议胰酶室温消化1-2分钟

5.复苏后不耐低温及长时间运输，低温天气建议干冰邮寄.

*本文涉及到胎牛血清及培养基均来自于evacell品牌

本实验数据及要点仅供参考