小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1

3T3-L1细胞是通过克隆3T3(swiss小鼠)细胞得到的连续亚株，细胞表达胰岛素。当3T3-L1细胞从快速分裂到长满且接触抑制时，细胞从前脂肪向脂肪样逆转。高血清含量的培养液可以促进3T3-L1细胞内脂肪的积累。

细胞特性

1） 来源：胚胎；成纤维；

2） 形态：成纤维细胞样

3） 含量：>1x106  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5)  用途：仅供科研使用。

细胞培养的步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备DMEM高糖培养基（E2102）；10%新生牛血清，(E03051）；1%双抗，(Evacell ,E3102)。

2） 培养条件： 气相：空气，95%,二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：推荐使用无血清冻存液（E4111）或者90%血清（E01010），10%DMSO，现用现配。

1）复苏细胞：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：

如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 
1、贴壁细胞，传代参考如下：
①. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS（EvaCell，E2119）润洗细胞1-2次。
②. 加2ml 0.25%胰蛋白酶消化液（E31031）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
③. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。 
④. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。 

3）细胞冻存：

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心5分钟，去除上清，按冻存数量加入无血清冻存液（E4111）或者血清及DMSO，冻存比例为90%FBS(Evacell ,E01010）+10%DMSO。 

 储存：液氮储存

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

培养注意事项 

1. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将 T25 瓶置于37℃培养箱放置2-4h。

2. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的完全培养基重悬 细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

3. 成纤维胞样，贴壁生长，高度汇合后可分化为脂肪细胞，常用于糖尿病、肥胖及相关疾病相关的基本细胞机制研究。

4. 推荐使用DMEM培养基，含10%小牛血清，不可使用胎牛血清。

5. 推荐传代比例1:2至1:4，传代周期2-3天。注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿

6. 该细胞起始接种密度应该在3000/cm2，并且在细胞达到80%融合或者密度介于5万-6万/cm2时传代，避免细胞完全融合。

7. 冻存复苏后漂浮的细胞有可能是存活的，应通过温和离心收集并继续培养。

8. 3T3-L1这样具有脂滴的细胞培养过程中受到压力的表现出现空泡现象正常，原因可能是培养基中缺乏谷氨酰胺，添加了抗真菌剂。CO2浓度较低对培养基中碳酸氢钠的影响或者使用的血清品质较低培养基的营养消耗殆尽。

9. 该细胞在DMEM(含1.5g/L NaHCO3)培养基中生长良好，大部分品牌的DMEM含有较高浓度的NaHCO3(3.7g/L),若使用DMEM(3.7g/L)培养基细胞时可能会影响细胞的生长速度和状态。

细胞常见问题

1）3T3-L1细胞在分化过程中出现异常怎么办？

答：细胞密度是影响3T3-L1细胞分化的重要因素，过低或过高的细胞密度都会影响分化效果；密度一般控制在40-80%的汇合度，如果太低，则会影响细胞生长，如果太高，则会导致细胞死亡。

2）3T3-L1细胞传代后容易出现细胞老化的情况怎么办？

答：在进行传代时，需要注意细胞的消化过程，该细胞对胰酶比较敏感，添加胰酶后约1-2分钟内细胞会脱落，因此消化时间的把控极其重要，同时避免过度打碎细胞团，以保证细胞的生长和分化能力。