人胶质母细胞瘤细胞

（A172）

A172人胶质母细胞瘤细胞是从一名53岁男性胶质母细胞瘤患者的脑组织中分离出来的。主要用于神经科学研究。A172人胶质母细胞瘤细胞粘附并扩散在培养皿表面，核型为n=80（80条染色体）。A-172细胞表达与间充质标记物（CD90、CD105、成纤维细胞活化蛋白、tenascin C）和血管生成诱导物（VEGF、FGF2（b）、TGFb1、血小板反应蛋白-1）相关的基因。与T98G细胞系的比较揭示了形态学和表面标记物表达的差异。两种细胞系都显示出a2平滑肌肌动蛋白的高表达。改变培养基中的胎儿血清浓度会影响表达特定表面抗原（如CD73和CD105）的细胞比例。相较于T98G细胞系，A172细胞在形态学和表面标记物表达上有所不同。此外，改变培养基中胎儿血清浓度会影响A172细胞表达特定表面抗原的比例。

细胞特性

1） 来源：脑

2） 形态：上皮细胞样  贴壁生长

3） 含量：>1x10⁶ 细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5）用途：仅供科研使用。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备DMEM  (E2102)培养基；10%优质胎牛血清(E01011)；1%双抗（E3102）。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：无血清冻存液（E4111）或者90%FBS (E01011)+10%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理：

1） 冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS（E2119）润洗细胞1-2次。

2. 加入0.25％胰蛋白酶（含EDTA）（E31031）于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的完全培养基来终止消化。 

3. 轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

三．细胞培养过程中常见问题与解决办法

1. 支原体污染：支原体清除困难，建议直接丢弃细胞并重新培养；预防需使用正规渠道血清（如ATCC认证），避免共用培养器具。

2. 细菌/真菌污染：立即丢弃污染细胞；污染早期可尝试高浓度双抗（如青霉素+链霉素）冲洗24-48小时后换液；预防需严格无菌操作（如酒精擦拭瓶身、紫外灭菌超净台），定期支原体检测。

3. 生长缓慢/停滞：调整血清浓度至10-20%，使用验证过的DMEM+10%FBS+1% 双抗的完全培养基；

严格控制胰酶消化时间（0.25%胰酶（含EDTA）37℃消化1-2分钟，显微镜下观察细胞间隙增大即终止）；定期检测培养箱CO₂浓度及温度稳定性；避免过度传代，传代比例控制在1:2-1:4，细胞密度达80-90%时传代。

4. 形态异常：处理消化劳损，要轻柔吹打（避免气泡），消化后立即加完全培养基终止；若细胞贴壁过紧，可滴加HEPES缓冲液使培养基变酸（pH6.8-7.0）促进脱落。碎片过多时，传代时用PBS润洗2次，离心（900rpm，3-5分钟）去除死细胞碎片；必要时用0.25%胰酶短时消化后重悬。

5. 减少实验影响：低代次保种，长期传代易发生遗传漂变，复苏后24h内尽量不换液

      本实验数据及要点仅供参考