A375人恶性黑色素瘤细胞

A-375人恶性黑色素瘤细胞系是从一位54岁女性患者的皮肤恶性黑色素瘤中分离，具有上皮样形态。A375细胞系最早由D.J. Giard等人在1975年建立，已广泛应用于肿瘤学研究和药物筛选。A375细胞的染色体数为亚三倍体，具有62条染色体模数，每个细胞通常含有9条标记染色体，并且在N2、N6和N22染色体上各有一个拷贝。作为NRAS突变体A375的同源对照细胞系，A375细胞是研究毒理学和免疫肿瘤学的重要模型，特别适合作为转染实验的宿主细胞。

细胞特性

1） 来源：人黑色素瘤

2） 形态：上皮细胞样，贴壁生长

3） 含量：>1x10⁶  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5）用途：仅供科研使用。

一．培养基及培养冻存条件准备

1） 准备87 %  DMEM基础培养基   (E2102)  ，10 %优质胎牛血清(E01011)，1% L-谷氨酰胺 ,1%丙酮酸钠（E2113） ，1%青霉素-链霉素溶液（E3102）

 2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：无血清冻存液（E4111）或者90%FBS (E01011)+10%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理：

1） 冻存细胞的复苏：

1.将所需的完全培养基提前放入37℃培养箱中预热30分钟，以便复苏A375细胞时使用。

2.从液氮罐中取出冻存的A375细胞管，迅速放入37℃水浴中，轻轻摇动至细胞完全解冻（约1-2分钟）。

3.将解冻后的A375细胞悬液转移至含有5-10毫升预热培养基的离心管中，轻轻混匀。

4.以1000 rpm离心5分钟，去除上清液，保留沉淀的A375细胞。

5.用适量新鲜培养基重悬A375细胞，确保细胞充分混匀。

6.将重悬后的A375细胞接种至预先准备好的T25或T75培养瓶中。

7.将培养瓶放入37℃的培养箱中，维持95%空气和5%二氧化碳的培养环境以促进A375细胞生长。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS（E2119）润洗细胞1-2次。

2. 加入0.25％胰蛋白酶（含EDTA）（E31031）于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的完全培养基来终止消化。 

3. 轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

3）A375细胞在琼脂中的克隆形成：

a. 准备琼脂培养基：将2倍浓度的DMEM基础培养基与等量的2%液体琼脂混合，制成1%琼脂培养基，以便用于A375细胞的克隆形成实验。

b. 铺底层琼脂：将1%琼脂培养基分注至培养皿中，静置至凝固。

c. 制备A375细胞悬液：将对数生长期的A375细胞消化成单细胞悬液，调整浓度至1×10⁴-1×10⁵ cells/ml。

d. 加入顶层琼脂：将A375细胞悬液与等量的1%液体琼脂混匀，迅速加入底层琼脂上，静置至凝固。

e. 加培养基：在琼脂表面小心加入培养基，避免破坏琼脂层。

f. 培养：将培养皿置于37°C、5%CO₂培养箱中，每3-4天更换培养基。

g. 观察克隆形成：通常2-3周后，在显微镜下可见肉眼可见的A375细胞克隆。

实验注意事项：

1. 温度控制：琼脂一定要45-50℃，太烫直接烫死A375细胞，太凉容易立刻凝固

2. 接种密度：由于A375细胞克隆能力强，密度太高，克隆会连成片无法计数，建议先做预实验，摸索最佳接种密度。

3. 保证实验时间足够：A375细胞一般要2周左右才肉眼可见克隆，不要太早终止。

4. 避免贴壁：上层胶一定要完全覆盖底层，不能让细胞碰到孔底，否则不算锚定非依赖生长。

4）A375细胞在成纤维细胞饲养层中的培养：

(1) 准备饲养层：在培养皿中接种适量成纤维细胞，待其生长至100%汇合，以便接种A375细胞。

(2) 处理饲养层：用PBS洗涤成纤维细胞，然后用含10μg/ml米托蒽醌的PBS处理2小时进行灭活。

(3) 洗涤：用PBS洗涤饲养层3次以去除灭活液。

(4) 接种A375细胞：将对数生长期的A375细胞接种至饲养层上，细胞密度根据实验需要调整。

(5) 培养：在37°C、5%CO₂培养箱中培养，2-3天更换一次培养基。

(6) 观察克隆形成：定期观察A375细胞在饲养层上形成的克隆。

三、注意事项

a. 无菌操作：整个操作过程需严格保持无菌，防止A375细胞污染。

b. 细胞状态监测：复苏和传代后24小时内应及时观察A375细胞状态，必要时更换培养基以去除死亡细胞。

细胞颗粒感：A375细胞在培养过程中可能会出现细胞内黑点和细胞外颗粒，建议使用优质胎牛血清和培养基。

      本实验数据及要点仅供参考