Bewo人绒毛膜肿瘤细胞

BeWo细胞是一种从绒毛膜癌患者胎盘中分离出来的细胞系，取自人绒癌脑转移组织。bewo细胞系在仓鼠颊囊移植传代8年体外培养获得，后利用移植瘤组织进行体外培养，并通过不同的传代方法衍生出多个亚系，如JEG-3是其衍生克隆，该细胞可以产生雌激素、孕激素、雌酮、雌二醇、雌三醇、hCG、胎盘催乳素、角蛋白。

细胞特性

1） 来源：人绒癌脑转移组织

2） 形态：上皮细胞样，贴壁生长

3） 含量：>1x10⁶  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5)  用途：仅供科研使用。

一．培养基及培养冻存条件准备

1） 准备F-12K（E2114）培养基；10%优质胎牛血清(E01011)；1%双抗（E3102）。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：无血清冻存液（E4111）或者90%FBS (E01011)+10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1） 冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS（E2119）润洗细胞1-2次。

2. 加入0.25％胰蛋白酶（含EDTA）（E31031）于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的完全培养基来终止消化。 

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

三．细胞培养过程中常见问题与解决办法

1. BeWo细胞传代后不生长：

（1）培养基选择：使用Ham's F-12K培养基，确保FBS的质量;

（2）胰酶消化时间：0.25% 胰蛋白酶（含EDTA）消化时间控制在1-2分钟，避免过度消化。

（3）传代后处理：传代后观察BeWo细胞密度和形态，必要时进行离心和重悬操作。

2. 生长缓慢或停滞:

检测血清批次活性，使用优质FBS(E01011)，必要时提高血清浓度至15%-20%短期刺激增殖;定期换液（每2天），补充葡萄糖、谷氨酰胺等消耗性成分;排除支原体污染（PCR检测），使用支原体清除试剂。

3.自发分化：Bewo细胞易向合体滋养层分化，表现为细胞融合、空泡化。可通过以下方法抑制：添加溴脱氧尿苷（BrdU）抑制DNA合成，维持未分化状态;使用胶原或明胶包被培养瓶，促进贴壁并减少分化;传代时避免过度消化，保持细胞间连接。

4.凋亡抑制:通过流式细胞术检测凋亡率（Annexin V-FITC/PI法），添加Caspase抑制剂（如Z-VAD-FMK）或抗氧化剂（N-乙酰半胱氨酸）减少氧化应激;营养缺乏.补充胰岛素、转铁蛋白等生长因子，维持细胞代谢平衡。

5.污染防控:严格无菌操作，使用HEPA过滤空气，培养箱定期紫外线消毒。污染后立即隔离，用70%乙醇擦拭瓶身，抗生素（如双抗）短期干预，但长期使用易导致耐药性。支原体：定期检测（DNA染色法），使用泰乐菌素或BM-Cyclin处理，污染严重时丢弃细胞。

      本实验数据及要点仅供参考