beNd.3细胞培养体系

（1）细胞的复苏

1)  将恒温水浴锅中的水预热到 37℃；

2)  准备一支 15ml 离心管，加入 5ml 含 10%FBS 的完全培养基，放入 37℃水浴锅中预热；

3)  戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中 复温晃动冻存管以提高复温速率；

4)  将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm 离心 5min；

5)  准备一个 T-25 培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入 4ml 完全培养基；

6)  离心完成后弃去上清，用 1ml 完全培养基重悬细胞后，转入 T-25 细胞培养中，混匀后转入 CO₂培养箱中培养静置。

（2）细胞的传代(细胞传代建议一传二）

1)  当细胞汇合度达到 85%以上时，可进行传代。

2)  在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；

3)  向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS 后，水平放置培养瓶，使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上 所有的面积，吸弃 PBS；

4)  向瓶内加入消化液 1ml，浸润底面后放入 37℃ CO₂培养箱中孵育 1~2min；

5)  孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中，将悬液吸入 15ml 离心管；

6)  1000rpm 离心 5min；

7)  准备两个新的 T-25 培养瓶，各加入 4ml 完全培养基。

8) 离心完成后，弃上清，用 2ml 完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入 2 个 T-25 培 养瓶，每个培养瓶各 1ml；

9) 水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于 37℃，5%CO₂培养箱中静置培养。

（3）细胞的冻存

建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例:

1. 细胞用细胞刮铲替代胰酶来对细胞进行处理。用无菌细胞刮铲刮拭细胞附着培养表面将细胞刮落，收集细胞。

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10^6~1×10^7个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

细胞形态问题

Bend.3细胞本身生长较慢，在低密度时会呈现不规则细胞形态，高密度时则呈规则纤维状，所以若在培养过程中发现细胞形态异常，则有可能是细胞密度低，建议细胞铺满密度较高时传代。

1.消化时间难控制

bEnd.3细胞培养时间越长越难消化，培养4天传代，一般消化3-5分钟；培养7天传代，一般消化5-10分钟。具体消化时间以显微镜下观察细胞状态为准。

2.细胞难消化

如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化： ① 准备一个无菌的 15ml 离心管，加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基；

 ② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；

 ③ 向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱 落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内

3.Bend.3细胞培养注意事项

1) 细胞培养过程中形态多样，细胞在低密度下形态不规则，细胞数量少，铺展面积大，高密度后形态会趋于一致，胞体密集，所以需要细胞胞体排列紧密的时候进行传代；

(2) 细胞培养过程中避免频繁换液，可以每隔2-3天换液或者半量换液一次；

(3) 培养过程中会产生10%左右活的单颗漂浮细胞，贴壁细胞密度偏低时，注意收集悬浮细胞，贴壁细胞密度偏高时，可以换液时丢弃；

(4) 接种量对细胞生长有影响，接种量过低细胞会有增殖缓慢，漂浮过多的现象。细胞增殖偏慢，初次传代建议1:2，细胞稳定后建议传代比例也不超过1:4；

(5)注意观察培养基颜色，颜色偏紫会导致细胞漂浮增加。该细胞对温度和pH较敏感，传代或换液前培养基可以常温复温4小时以上；避免使用pH改变（偏酸：颜色偏黄；偏碱：颜色偏紫红）的培养基；

(6) 细胞传代过程中若出现单次消化时间过长，可进行分次消化，切不可将细胞强行吹下来，以避免吹打造成细胞机械损伤。